1、流動相

（1）流動相中有機(jī)溶劑的類型和比例，會影響色譜分離的選擇性。對于反相色譜模式，常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈和*。可以通過改變流動相中的有機(jī)相種類或調(diào)整其比例，來改變選擇性和分離度。

（2）流動相的pH值影響分離度。對于中性的化合物，流動相pH值的改變不會對其選擇性有太大的影響；對于酸性化合物和堿性化合物(可解離的化合物)，影響較大。

（3）可以通過添加緩沖鹽來調(diào)整流動相的離子強(qiáng)度，來改善目標(biāo)化合物與固定相之間的保留。

2、固定相

固定相中鍵合相的類型，填料的孔徑，封端類型以及色譜柱的粒徑和尺寸都會影響色譜分離的結(jié)果。其中最主要的因素是鍵合相的選擇。當(dāng)你采用C18固定相無法得到好的分離結(jié)果，可以考慮極性較強(qiáng)的C8固定相，或者選擇性與其有較大差異的苯基己基柱進(jìn)行嘗試，或者采用封端的色譜柱代替未封端的色譜柱。

3、硬件系統(tǒng)

對硬件系統(tǒng)的一些參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，也可以在一定程度上改善色譜分離的結(jié)果。比如較高的采樣速率；采用較小內(nèi)徑的管線和較小的流通池來減小擴(kuò)散體積和延遲體積減小色譜峰的展寬；或者通過提高色譜柱的柱溫來改善分離度。

1、所有組分響應(yīng)都發(fā)生了大致相同程度的改變，可能的原因

（1）進(jìn)樣問題：檢查樣品瓶和進(jìn)樣針，保證樣品濃度和進(jìn)樣體積沒有變化。

（2）檢測器問題：檢查檢測器所有參數(shù)設(shè)置，如果基線噪音很大，通常不是檢測器而是系統(tǒng)污染了。

（3）該組分結(jié)構(gòu)是否穩(wěn)定，進(jìn)樣過程中可能降解。

（4）色譜條件是否發(fā)生改變，如流動相比例、pH 值等。

（5）色譜柱改變，選擇性改變，效應(yīng)值也會發(fā)生改變。 

2、只有部分組分響應(yīng)下降了

（1）看一看它們是否相似的揮發(fā)性或官能團(tuán)，針對不同類型的樣品，盤查的角度可以有所不同：具有極性官能團(tuán)（如-OH, -NH, -SH）的樣品易被吸附，對污染的系統(tǒng)進(jìn)行簡單的維護(hù)。

（2）這些成分性質(zhì)是否穩(wěn)定，檢測過程中是否發(fā)生降解。 

導(dǎo)致這種結(jié)果的原因有很多：

如果樣品穩(wěn)定的話，首先排除儀器的故障，有氣泡是最主要的一種，氣泡的產(chǎn)生會導(dǎo)致進(jìn)樣之間體積的不規(guī)律變化。

如果樣品之間的濃度相差很大，而進(jìn)樣2-3針后同一個峰的峰面積保持不變，那么可能是樣品殘留。

峰面積的減少也有可能是溫度引起的，但是這個影響很小，小于2%。如果你把樣品從冰箱里拿出來放到進(jìn)樣器里，它會慢慢的升溫，體積就會變大。這樣前后的進(jìn)樣體積就有差別了。

流速的隨機(jī)變化也會導(dǎo)致峰面積變化。流速改變的另一個潛在原因是系統(tǒng)高壓部位漏液了，這個應(yīng)該很容易發(fā)現(xiàn)。

復(fù)雜樣品中如果有肩峰（與目標(biāo)峰局部分離），軟件就很難判斷基線在哪里。這時采用手動積分或者用強(qiáng)制基線自動積分將會改善積分的重現(xiàn)性。樣品本身也會造成峰面積變化。在反相色譜中發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)在開始的梯度中不能*洗脫，殘留的會出現(xiàn)在接下來的空白梯度中。這些鬼峰只在特定的蛋白質(zhì)和洗脫程序中出現(xiàn)。如果是這樣，就要在分析樣品后添加空白。另外，蛋白質(zhì)會不可逆的黏附在有些柱子內(nèi)，隨著進(jìn)樣的增加，樣品的峰面積會慢慢變大。

壓力波動是在日常工作中常常遇到的問題，通常來說，壓力波動與色譜柱的關(guān)系并不大，主要是儀器系統(tǒng)的問題，下面兩點zui值得注意：

1、泵內(nèi)有氣泡；

2、單向閥或密封墊滲漏。

解決的途徑如下：

1、溶劑過濾后超聲脫氣；使用在線脫氣機(jī)；打開purge閥排氣泡，或者在溶劑中充氦氣；

2、清洗更換單向閥；更換泵密封墊。

1、短期保存色譜柱

反相柱：使用緩沖液或含緩沖鹽的流動相，實驗完成后應(yīng)用20-30柱體積的甲醇或乙腈和水的10：90混合物進(jìn)行沖洗，在用甲醇或乙腈和水的90：10混合物進(jìn)行沖洗。如需過夜保存，可將流速保持在0.1到0.2mL/min。

正相柱：用流動相洗出樣品，再用高比例正己烷：異丙醇沖洗色譜柱，保存。

2、保存色譜柱如色譜柱要長時間保存

必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑疊氮hua鈉或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。特殊類型色譜柱的儲存，需參考色譜柱說明書，使用廠商推薦的溶劑。 

1、流速降低

檢查并重新設(shè)置流速；檢查泵是否有氣泡；檢查泵密封墊是否滲漏，以及單向閥和其它系統(tǒng)滲漏。

2、流動相組成改變

檢查系統(tǒng)是否有漏液點；排除系統(tǒng)氣泡；補(bǔ)足溶劑瓶；確保梯度系統(tǒng)比例正確；預(yù)混合流動相進(jìn)行等梯度洗脫；流動相組成的問題。在反相色譜中，保留因子k和流動相中有機(jī)相的比例是成指數(shù)關(guān)系的。通常，有機(jī)相變化1%，保留時間會變化5%-15%，一般是10%。pH變化0.1會導(dǎo)致保留時間變化10%，所以要準(zhǔn)確的測量pH，并且要校正好pH計，在反相色譜中隨著pH的增加，酸性化合物保留時間縮短，而堿性化合物延長；離子對試劑的濃度會影響離子型化合物組分的保留時間。帶有和離子對試劑相反電荷的分析物的保留時間會縮短，帶同樣電荷的會延長。正相色譜的保留時間對流動相中的極性成分非常敏感，任何情況下水都是一個麻煩，使用半飽和水的非極性溶劑比如正己烷和二氯甲烷來避免這個問題。

3、鍵合相流失

對于常用硅膠型色譜柱，要保持流動相pH2~8之間；對于*pH（>10）或極低pH（<2）的工作，使用高穩(wěn)定性固定相，聚合物或高穩(wěn)定性固定相柱。

4、硅膠填料的活化位點

使用流動相改性劑;流動相中加競爭堿;固定相用更高覆蓋度的填充料。

5、溫度降低

控制柱溫。通常溫度每變化1℃保留時間變化1%-2%。一般情況下影響沒有那么大，顯然這種問題用柱溫箱就可以避免。

1、色譜柱填料的活性位點

使用流動相改性劑，競爭堿（堿性化合物，如三乙胺）或增加緩沖液強(qiáng)度，使用高覆蓋率的柱填料。

2、流動相組成改變

檢查系統(tǒng)是否有漏液點；排除系統(tǒng)氣泡；補(bǔ)足溶劑瓶；確保梯度系統(tǒng)比例正確；預(yù)混合流動相進(jìn)行等梯度洗脫。

3、樣品過載 

減少樣品量或使用較大內(nèi)徑或更長的色譜柱。

4、鍵合相或硅膠基流失 

使用溫和pH的流動相；使用耐受高pH或低pH專用硅膠柱，聚合物柱或其它高/低pH柱。

5、 色譜柱老化

使用保護(hù)柱，或高穩(wěn)定性鍵合相聚合物、混合型或高穩(wěn)定性柱。

1、液相系統(tǒng)沒有平衡好，柱子里的流動相一直在變化，導(dǎo)致基線波動；

2、沒有脫氣機(jī)的儀器，當(dāng)流動相未脫氣或脫氣未*時，基線會出現(xiàn)尖刺峰；

3、當(dāng)色譜柱被污染時，也會造成基線波動；

4、檢測器的流通池被污染，造成吸收的不恒定，此時需要清洗流通池；

5、檢測器燈能量不足時，吸收會變得不穩(wěn)定，這時基線一般也不穩(wěn)定，特別是在低波長處尤為明顯；

6、當(dāng)使用低波長檢測時，有時流動相會使用兩相或以上的等度，這時混合器的很小的混合比例的誤差都會被放大，很有可能會使基線發(fā)生波動；

7、流動相里的有機(jī)相的截止波長最好要小于檢測波長20nm以上；

8、實驗室環(huán)境不穩(wěn)定（比如溫度忽高忽低，氣流不斷變化等）；

9、儀器出現(xiàn)問題也會造成基線波動，這種情況下通常也會出現(xiàn)壓力不穩(wěn)。比如流動相過濾頭堵塞、入口主動閥濾芯污染、單向閥被污染物堵塞、泵頭有氣泡、系統(tǒng)流路漏液，比如管路裂開、peek接頭沒*連上色譜柱而導(dǎo)致的泄露等。

色譜柱使用壽命大約為1000針，而保護(hù)柱的壽命大約為280針。主要受色譜條件及保存條件影響。表現(xiàn)形式：柱壓升高、柱效降低、峰形拖尾、峰形變寬、保留時間發(fā)生變化、固定相流失等。

1、色譜條件，有兩種基本情況：

（1）在相同實驗中，以前使用的色譜柱壽命長很多，這種情況，應(yīng)該檢查一下色譜條件是否保持一致。樣品的組成，樣品中強(qiáng)吸收的污染物會破壞色譜柱的柱效。或者管路的密封圈是否完好？脫落的密封圈會堵塞色譜柱過濾器和填料的頂層，從而影響樣品的分布。如果可以確認(rèn)色譜條件沒有變化，那么可以推測是柱床松動的原因。在實驗室和運輸過程中色譜柱劇烈的震動都會導(dǎo)致柱床松動；

（2）在本實驗中用過的所有的色譜柱在使用相同次數(shù)后全部損壞，最大可能是樣品中的成分吸附在色譜柱的頂端。可能是在流動相中不溶的沉淀物或者是強(qiáng)吸收的物質(zhì)；

（3）采用合適的樣品準(zhǔn)備技術(shù)處理樣品。用和分析柱相似的固相萃取柱進(jìn)行固相萃取（SPE）；

（4）使用保護(hù)柱。保護(hù)柱是作為犧牲柱裝在色譜柱前使用的，出現(xiàn)問題的時候就會被替換掉。保護(hù)柱的填料和裝填技術(shù)必須和分析柱一樣；

（5）反沖柱子。反現(xiàn)在的裝填技術(shù)可以使柱子承受反沖，能更好的去除柱頭端的污染物。

2、使用方法不對，按照生產(chǎn)商的說明使用柱子的話一般很少發(fā)生

（1）流動相pH超出使用范圍，導(dǎo)致的柱子鍵和相水解或基質(zhì)溶解。樣品用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶解的話也會發(fā)生；

（2）高溫也會導(dǎo)致色譜柱損壞，如高溫會加速鍵合相溶解；

（3）特殊柱子注意事項，例如氨基柱可以和醛，酮反應(yīng)。氨基柱在不含緩沖鹽的水溶液中會顯強(qiáng)堿性，分解部分硅膠；

（4）暴露在錯誤溶劑中的柱子也會發(fā)生坍塌。因為這些柱子是基于非常松散的結(jié)構(gòu)。他們是因顆粒之間的黏著而部分的結(jié)合在一起的。如果置于能破化這種黏著的流動相中，柱床很有可能會坍塌。氰基柱在中性溶液，苯基柱在THF中有時就會發(fā)生這種問題。這也是不要沖洗柱子的另一個理由。 

1、色譜柱污染

在開始時沒問題，在使用一段時間后出現(xiàn)這個問題，可能是由于污染引起的。這時需要對色譜柱加強(qiáng)沖洗，即使用比方法流動相更強(qiáng)的溶劑沖洗色譜柱。

2、保護(hù)柱失效

如果樣品基質(zhì)比較臟，使用一段時間之后，發(fā)現(xiàn)的峰分叉或拖尾等問題，很有可能是保護(hù)柱失效造成的。一般粗略判斷標(biāo)準(zhǔn)，塔板數(shù)、壓力或分離度的改變超過10%，就需要更換保護(hù)柱了。保護(hù)柱是消耗品，建議直接更換，不需要再生。

3、接頭連接不正確

如果色譜柱在使用過程中發(fā)現(xiàn)每個峰的峰形都出現(xiàn)問題，先考察是否有連接問題。管線可能太長或太短，這種情況可能導(dǎo)致滲漏或峰分叉/拖尾。如果管線太長，密封圈位置不當(dāng)，將發(fā)生滲漏。如果管線推出的距離不夠，將會產(chǎn)生一段死空間，形成混合腔，導(dǎo)致柱外體積，使峰形變壞。

4、溶劑效應(yīng)

在反相LC中、如使用100%有機(jī)溶劑或100%強(qiáng)溶劑，大體積進(jìn)樣時，將使色譜峰過早洗脫出色譜柱，導(dǎo)致峰變形。進(jìn)樣溶劑改為用水稀釋，與流動相更為兼容，即使進(jìn)樣體積較大也不會出現(xiàn)峰變形。較早流出的峰或靠近溶劑前沿的峰更容易出現(xiàn)拖尾。在液相色譜中用溶于流動相的小體積進(jìn)樣最為理想。

5、樣品過載

當(dāng)進(jìn)樣量超過柱子的容量，樣品峰會呈現(xiàn)分叉或拖尾，解決方案就是減少進(jìn)樣量。

6、色譜柱塌陷

由于柱塌陷引起的峰分叉，很難修復(fù)。如果流動相pH>7或在色譜柱pH耐受圍臨界點附近長時間使用，是比較容易造成硅膠填料溶解塌陷。如果出現(xiàn)色譜柱塌陷，您會看到色譜圖中的每個峰峰形都會發(fā)生變化（峰拖尾、加寬或分叉），短時間內(nèi)可以反方向運行，建議直接更換色譜柱。日常使用的過程中注意將溫度降低到40℃以下，特別是使用高pH流動相時。

7、柱前篩板部分堵塞長期分析臟樣品

如果沒有保護(hù)柱或在線柱前過濾器，顆粒物和強(qiáng)吸附物很可能在柱入口篩板發(fā)生堵塞，同時伴隨著壓力升高，解決辦法一般是色譜柱反沖。

8、色譜柱性能下降

使用色譜柱時，會用其分析各種目標(biāo)物、使用各種流動相并分離不同的樣品基質(zhì)，經(jīng)過長時間的使用，色譜柱會受到這些物質(zhì)的影響發(fā)生一些微妙的變化，從而引起峰分叉、拖尾或保留時間的改變。